RESUMEN

El objetivo de este trabajo fue estudiar la contribución de la flora indígena a la composición volátil del vino en fermentaciones inoculadas. Para ello se empleó mosto Parellada que fermentó con sus levaduras indígenas (fermentación control), mosto Parellada inoculado (fermentación inoculada mixta) y mosto Parellada esterilizado e inoculado con S. cerevisiae cepa Na33 (fermentación inoculada pura). Los resultados obtenidos en la fermentación inoculada pura mostraron que S. cerevisiae produjo cantidades apreciables de acetato de isoamilo, hexanoato de etilo, octanoato de etilo y decanoato de etilo. Sin embargo, las levaduras indígenas también contribuyeron a la síntesis de ésteres ya que la concentración total de estos compuestos fue mayor en los vinos obtenidos de la fermentación inoculada mixta que en los obtenidos de la fermentación inoculada pura. Acetato de 2-feniletilo sólo se sintetizó por las levaduras indígenas cuando no compitieron con la levadura S. cerevisiae inoculada. La concentración de alcoholes totales fue semejante en los vinos obtenidos de las tres fermentaciones. En cuanto a los ácidos, la mayor concentración correspondió a la fermentación inoculada mixta. Las levaduras indígenas contribuyeron de forma significativa a la síntesis de estos compuestos y S. cerevisiae sintetizó cantidades apreciables de ácidos grasos de cadena corta.

Palabras clave: composición volátil del vino blanco; levaduras indígenas; Saccharomyces cerevisiae; mostos inoculados; fermentación alcohólica.

INTRODUCCIÓN

Los compuestos formados durante la fermentación alcohólica influyen de forma decisiva en la composición volátil del vino. La mayor parte de los compuestos volátiles que se producen durante el metabolismo de las levaduras como etanol y glicerol contribuyen de forma escasa pero fundamental al aroma del vino. Los principales grupos de compuestos que forman el aroma de fermentación son ácidos, alcoholes superiores y ésteres (Lambrechts y Pretorius, 2000). En muchas bodegas se inocula el mosto con levaduras seleccionadas, habitualmente Saccharomyces cerevisiae, después de limitar el crecimiento de las levaduras indígenas del mosto añadiendo SO₂. Sin embargo, muchos enólogos consideran que la diversidad de levaduras es esencial para el desarrollo favorable del aroma del vino. Estas últimas bodegas dependen, para la elaboración del vino, de la flora natural de levaduras o de las levaduras que están presentes en los equipos y que contaminan el mosto de año en año. En las fermentaciones no inoculadas, el producto final es el resultado de la acción combinada de varias cepas de levaduras que crecen más o menos de forma sucesiva a lo largo de la fermentación. Las primeras etapas de la fermentación están dominadas por las levaduras no-Saccharomyces, cuyo crecimiento declina rápidamente dada su sensibilidad al etanol; posteriormente las cepas de S. cerevisiae, más tolerantes al etanol, empiezan a ser dominantes y son las que completan el proceso de vinificación.

Lema et al. (1996) encontraron que la composición química del vino es diferente dependiendo de que la fermentación se realice con levaduras inoculadas o con levaduras indígenas. Zohre y Erten (2002), utilizando mosto estéril inoculado con diferentes levaduras, observaron que la concentración de acetato de etilo producida en fermentaciones mixtas (Kloeckera apiculata, Candida pulcherrima, Saccharomyces cerevisiae) fue mayor que la producida solamente por S. cerevisiae. Fraile et al. (2000, 2001) y Ancín et al. (2004) observaron que la misma levadura seleccionada actúa de diferente forma dependiendo del tipo de vinificación. La población de levaduras indígenas puede ser un factor determinante que influye sobre el predominio de la levadura inoculada (Fleet y Heard, 1993).

La inoculación del mosto con levaduras seleccionadas minimiza la influencia que las levaduras indígenas ejercen sobre la calidad del vino, aunque no impide el crecimiento y la actividad metabólica de las levaduras indígenas, como las cepas de S. cerevisiae procedentes de la bodega u otras especies salvajes como Kloeckera apiculata y Hanseniaspora uvarum (Heard y Fleet, 1986; Lema et al., 1996; Egli et al., 1998; Henick-Kling et al., 1998). Sin embargo, se sabe poco sobre la contribución de las levaduras indígenas a la síntesis de compuestos volátiles durante las fermentaciones inoculadas. Por ello, el objetivo de este trabajo fue estudiar la contribución de la flora indígena y de una cepa inoculada de S. cerevisiae a la formación de compuestos volátiles durante fermentaciones inoculadas. Para ello se empleó mosto Parellada que fermentó con sus levaduras indígenas (fermentación control), mosto Parellada inoculado (fermentación inoculada mixta) y mosto Parellada esterilizado e inoculado con S. cerevisiae cepa Na33 (fermentación inoculada pura).

MATERIALES Y MÉTODOS EXPERIMENTALES

Muestras y vinificación

La variedad de uva empleada fue Vitis vinífera var. Parellada. La uva después de ser estrujada y despalillada, se sometió a prensado y filtrado. Al mosto obtenido se le añadió metabisulfito potásico hasta alcanzar una concentración de 20 mg/l de SO₂ total. Esta concentración permitirá que las levaduras indígenas contribuyan en el desarrollo de la fermentación alcohólica. 6 l del mosto se esterilizaron para eliminar las levaduras indígenas, mientras que 12 l no se trataron.

El mosto no esterilizado se dividió en 4 alícuotas de 3 l cada una. Dos fermentaron con sus levaduras indígenas (fermentación control) y otras dos se sembraron con la cepa de levadura seca activa S. cerevisiae subsp. cerevisiae (cepa Na33) de manera que se llevó a cabo por las levaduras indígenas y la cepa inoculada (fermentación inoculada mixta). El mosto esterilizado se dividió en dos alícuotas de 3 l cada una que se inocularon con la misma cepa de levadura (cepa Na33), de forma que la fermentación fue conducida únicamente por esta levadura (fermentación inoculada pura). La cepa de levadura seca activa S. cerevisiae subsp. cerevisiae (cepa Na33) fue seleccionada en la Estación de Viticultura y Enología de Navarra (Olite, España) y comercializada por Lallemand (España). Se inocularon en el mosto 0,2 g/l de la cepa Na33 (número de células viables/ml ³ 2 x 10⁹). Para ello 0,65 g de levadura seca se rehidrataron en 7,5 ml de agua destilada, conteniendo 0,07 g de sacarosa, en un matraz esterilizado; se mantuvo en este medio durante 30 minutos a 35 ºC. El mosto se agitó durante la inoculación para conseguir una distribución homogénea.

Las fermentaciones se realizaron en fermentadores de vidrio de 3,5 l de capacidad provistos de tapa esmerilada con dos orificios, uno para la toma de muestras y otro en el que se colocó una trampa de CO2 para permitir su salida e impedir la entrada de aire durante la fermentación. El orificio para la toma de muestras se tapó con un septum durante el transcurso de la fermentación. Las fermentaciones se realizaron a temperatura controlada de 18 ºC en una estufa refrigerada Selecta (Barcelona, España). Para el trabajo, se tomaron muestras de los mostos iniciales, y al 25%, 50% y 75% de azúcares consumidos así como al final de la fermentación (azúcares reductores <2,5 g/l). Todos los recipientes y materiales que estuvieron en contacto con las muestras fueron previamente esterilizados.

Análisis de los compuestos volátiles por cromatografía gaseosa

Fue necesario el uso de dos métodos de análisis debido a que los compuestos volátiles del vino a analizar presentan volatilidades diferentes y se encuentran en diferentes rangos de concentración. Para el análisis de compuestos de alta volatilidad y alta concentración se empleó el método descrito por Fraile et al. (2000). Estos compuestos se analizaron por GC-FID (modelo 14B, Shimadzu, Kioto, Japón). Los compuestos de volatilidad media y que, en general, presentan menores concentraciones que los anteriores, fueron previamente concentrados y extraídos mediante extracción en fase sólida según el método descrito por López et al. (2002). Posteriormente el extracto se analizó por GC-MS (modelo GCQ, Finnigan, San José, Estados Unidos) según el método descrito por Garde-Cerdán y Ancín-Azpilicueta (en prensa). De cada una de las muestras tomadas se hicieron dos extracciones y de cada extracción dos análisis cromatográficos de manera que los resultados que aparecen en las figuras corresponden a la media de 8 análisis, ya que las fermentaciones se realizaron por duplicado.

Análisis estadístico

Todos los resultados que se muestran en las figuras están expresados como la media y la desviación estándar. Los datos se analizaron estadísticamente usando el análisis de la varianza. Las diferencias entre las medidas fueron comparadas mediante el test LSD con un nivel de probabilidad de 0,05, empleando el programa estadístico SPSS versión 6.0.

RESULTADOS Y DISCUCIÓN

Ésteres

En la Figura 1a se presenta la concentración de ésteres totales, que corresponde a la suma de todos los ésteres cuantificados excepto acetato de etilo ya que éste contribuye de diferente manera al aroma del vino (Lema et al., 1996) y acetato de 2-feniletilo que distorsiona los resultados debido a las altas cantidades formadas en la fermentación espontánea. La mayor formación de ésteres se produjo en la fermentación inoculada mixta (7,3 mg/l) seguida por la fermentación inoculada pura (5,3 mg/l) mientras que en la fermentación control se produjo una cantidad de ésteres muy inferior a las anteriores (0,91 mg/l). Los ésteres se sintetizaron principalmente después del 25% de azúcares consumidos (Figura 1a), debido a que su formación está inhibida por la presencia de oxígeno (Jackson, 1994). Los resultados de la fermentación inoculada pura con Saccharomyces muestran que esta levadura produjo cantidades importantes de ésteres durante la fermentación (Figura 1a). Sin embargo, las levaduras indígenas contribuyeron de forma importante a la concentración de ésteres del vino ya que en la fermentación inoculada mixta la concentración de ésteres fue superior que en la inoculada pura. La muestra control presentó baja concentración de ésteres a pesar de tener más variedad de levaduras que las muestras inoculadas. Por tanto, parece que la complejidad de levaduras no compensó la escasa población de estos microorganismos que hay en la vinificación en blanco, donde el mosto no se macera en contacto con los hollejos.

El acetato de etilo, el éster mas abundante del vino, se formó en menor cantidad en las fermentaciones inoculadas, pura y mixta, que en la fermentación control (Figura 1b). Esto se debió probablemente a que la velocidad de fermentación de la muestra con levaduras indígenas fue baja y a que las levaduras Saccharomyces sintetizan menos acetato de etilo que las no-Saccharomyces (Plata et al., 2003; Rojas et al., 2001). Este compuesto en bajas concentraciones (<50 mg/l), puede ser positivo y aportar complejidad al aroma; sin embargo, en concentraciones por encima de 150 mg/l, puede aportar al vino olor a vinagre (Amerine y Roessler, 1983). La concentración de acetato de isoamilo fue inferior en los vinos obtenidos de la fermentación espontánea que en los obtenidos de las fermentaciones inoculadas, donde la concentración de este éster fue semejante (Figura 1c). Estos resultados indican la escasa contribución que tuvieron las levaduras indígenas a la formación de este compuesto. En los vinos obtenidos en las fermentaciones inoculadas con la cepa Na33 la concentración de este éster estuvo por encima de su umbral de percepción (1 mg/l) según Simpson (1979).

El acetato de 2-feniletilo se formó en la fermentación espontánea en gran cantidad mientras que prácticamente no se sintetizó en las fermentaciones inoculadas (Figura 1d). Estos resultados indican que S. cerevisiae contribuyó escasamente a la formación de este compuesto. Rojas et al. (2003) encontraron que Hanseniaspora guilliermondii presenta una elevada producción de acetato de 2-feniletilo en fermentaciones puras. Los ésteres etílicos, hexanoato de etilo, octanoato de etilo y decanoato de etilo prácticamente no se formaron en la fermentación control mientras que se produjeron en cantidades apreciables en las fermentaciones inoculadas (Figuras 1e-g). Si se comparan las concentraciones de estos ésteres entre los vinos obtenidos de las fermentaciones inoculadas pura y mixta se observa que las levaduras indígenas contribuyeron de forma importante a la síntesis de hexanoato de etilo pero no a la de octanoato y decanoato de etilo. Estos ésteres se encontraron por encima de su umbral de percepción (hexanoato de etilo, 0,08 mg/l; octanoato de etilo 0,58 mg/l; decanoato de etilo, 0,5 mg/l) (Peinado et al., 2004) en los vinos obtenidos de las fermentaciones inoculadas, con la excepción del decanoato de etilo en el vino procedente de la fermentación inoculada mixta.

Alcoholes superiores y 3-(metiltio)-1-propanol

En la Figura 2a se observa que no hubo diferencias significativas en la concentración final de alcoholes superiores (suma de n-propanol, isobutanol, alcoholes isoamílicos, n-hexanol, alcohol bencílico, 2-feniletanol, tirosol y triptofol) entre los tres tipos de fermentaciones (control, 190,1 mg/l; inoculada mixta, 210 mg/l; inoculada pura, 209 mg/l). A diferencia de lo que ocurría con los ésteres, los alcoholes estudiados excepto los alcoholes isoamílicos, tirosol y triptofol se formaron al inicio de la fermentación alcohólica (Figura 2a) coincidiendo con la fase de mayor consumo de aminoácidos, que son sus precursores (Nykänen, 1986). En ningún caso la concentración de estos compuestos sobrepasó el límite de 300 mg/l considerado como el límite a partir del cual los alcoholes superiores deterioran el aroma del vino (Rapp y Mandery, 1986).

No se observaron diferencias en la concentración de n-propanol entre los vinos obtenidos de las diferentes fermentaciones (Figura 2b). Estos resultados coinciden con los encontrados por Mamede et al. (2005) que no observaron diferencias en la formación de este compuesto por diferentes especies de levaduras. El isobutanol se formó al inicio de la fermentación en cantidad muy superior en la fermentación control que en las fermentaciones inoculadas. No se observaron diferencias en la concentración final de isobutanol entre la fermentación mixta y pura (Figura 2c). Este resultado sugiere que la formación de este compuesto se debió principalmente a las levaduras indígenas, que lo formaron sobre todo cuando no compitieron con levaduras Saccharomyces inoculadas. Los alcoholes isoamílicos fueron los componentes mayoritarios de este grupo y su concentración final fue mayor en los vinos obtenidos de las fermentaciones inoculadas que en el vino resultante de la fermentación control (Figura 2d). No se observaron diferencias entre la fermentación inoculada mixta y la fermentación inoculada pura por lo que parece que la flora indígena contribuyó escasamente a la síntesis de estos compuestos. Giudici et al. (1990) y Romano et al. (2003) también encontraron que S. cerevisiae produce cantidades importantes de alcoholes isoamílicos en fermentaciones llevadas a cabo con diferentes variedades de uva. El umbral de percepción para los alcoholes isoamílicos en el vino está entre 60 y 180 mg/l (Ribereau-Gayon, 1978; Simpson, 1979) de manera que los vinos obtenidos de las tres fermentaciones estuvieron dentro de este rango.

El n-hexanol y el alcohol bencílico (Figuras 2e y 2f) se formaron en mayor cantidad en la fermentación espontánea e inoculada mixta que en la fermentación pura, por lo que la flora indígena parece que contribuyó de forma apreciable a su síntesis. Clemente-Jiménez et al. (2005) encontraron que la síntesis de n-hexanol, durante la fermentación, se debe principalmente a las levaduras no-Saccharomyces lo que podría explicar la mayor formación de este compuesto en las fermentaciones con presencia de flora indígena (control e inoculada mixta). El 2-feniletanol presentó, desde el inicio de la fermentación, concentraciones muy superiores en la muestra control que en las muestras inoculadas (Figura 2g), por lo que parece que las levaduras no-Saccharomyces son altamente productoras de este alcohol. Por otra parte, las levaduras indígenas no contribuyeron a la síntesis de 2-feniletanol en la fermentación inoculada mixta; esto indica que la inoculación de un mosto con Saccharomyces hizo que las levaduras indígenas sintetizaran menos cantidad de este alcohol. El umbral de percepción de 2-feniletanol se encuentra entre 25 y 105 mg/l (Amerine y Roessler, 1983) de manera que sólo los vinos procedentes de la fermentación espontánea estuvieron dentro de este rango de concentraciones. El tirosol presentó mayor concentración en los vinos obtenidos de la fermentación inoculada mixta que en los obtenidos de las fermentaciones control e inoculada pura (Figura 2h), por lo que parece que la flora indígena contribuyó a su síntesis. La concentración de triptofol (Figura 2i) no presentó diferencias significativas entre los diferentes vinos por lo que el tipo de levadura que condujo la fermentación parece que no afectó a la síntesis de este compuesto. El 3-(metiltio)-1-propanol se sintetizó en mayor cantidad en la fermentación control, sin embargo, los vinos obtenidos de las tres fermentaciones presentaron concentraciones similares de este compuesto (Figura 2j), por lo que parece que el tipo de levadura no afectó a su concentración en el vino. Este alcohol es considerado como el más importante de los compuestos azufrados y además influye en el aroma del vino, debido a su bajo umbral de percepción (2 mg/l) (Meilgaard, 1981) y a su desagradable aroma.

Ácidos

En la Figura 3a se observa que en la fermentación inoculada mixta se sintetizaron más cantidad de ácidos (25,3 mg/l) que en la fermentación inoculada pura (15,3 mg/l), por lo que las levaduras indígenas contribuyeron de forma apreciable a la formación de estos compuestos. En la fermentación control se sintetizaron menos ácidos (4,04 mg/l) que en las fermentaciones inoculadas. En todas las fermentaciones la formación de todos los ácidos, excepto la de succinato ácido de etilo, tuvo lugar en la primera mitad de la fermentación (Figura 3a). Radler (1978) encontró que la síntesis de ácidos grasos saturados se realiza principalmente al inicio de la fermentación, aunque esta síntesis continúa en ausencia de oxígeno.

El ácido butírico presentó mayor concentración en los vinos obtenidos de la fermentación inoculada mixta que en los obtenidos de las fermentaciones control e inoculada pura donde este ácido se encontró en concentraciones similares; por ello la flora indígena parece que contribuyó a su formación (Figura 3b). Los ácidos hexanoico, octanoico y decanoico se formaron en cantidades muy bajas en la fermentación control mientras que en las fermentaciones inoculadas se sintetizaron en cantidades importantes (Figuras 3c-e). Estos compuestos presentaron mayor concentración en los vinos obtenidos de la fermentación inoculada mixta que en los obtenidos de la fermentación inoculada pura; por tanto las levaduras indígenas contribuyeron a su formación. Los ácidos grasos de cadena media son tóxicos para las levaduras y son responsables de ralentizaciones y paradas de fermentación (Lafon-Lafourcade et al., 1984). Herráiz et al. (1990) encontraron que S. cerevisiae forma altas cantidades de estos compuestos en fermentaciones puras y mixtas.

Los vinos obtenidos de la fermentación inoculada pura presentaron mayor concentración de ácido dodecanoico que los obtenidos de las fermentaciones control e inoculada mixta; por ello parece que Saccharomyces sintetizó más ácido dodecanoico cuando no compitió con otras levaduras (Figura 3f). Los ácidos tetradecanoico y hexadecanoico se formaron en cantidades similares en todas las muestras, por lo que parece que la cepa que condujo la fermentación no afectó a su síntesis (Figuras 3g y 3h). Los ácidos grasos de cadena larga, el ácido hexadecanoico entre ellos, son precursores esenciales en la síntesis de muchos componentes lipídicos encontrados en las levaduras (Ratledge y Evans, 1989). El succinato ácido de etilo, a diferencia del resto de ácidos, se formó tras el 25% de azúcares consumidos (Figura 3i). Al final de la fermentación este ácido presentó mayor concentración en los vinos obtenidos de las fermentaciones control e inoculada pura que en los obtenidos de la fermentación inoculada mixta.

CONCLUSIONES

Se obtuvo mejor composición volátil en los vinos donde se realizó la fermentación inoculada mixta que en los vinos obtenidos de fermentaciones inoculadas puras y espontáneas. Esto es debido a que las levaduras indígenas contribuyeron de forma importante a la síntesis de compuestos volátiles en la fermentación inoculada con S. cerevisiae. Las levaduras indígenas contribuyeron a la formación de ésteres totales y ácidos grasos de cadena corta cuando compitieron con la levadura S. cerevisiae inoculada mientras que su contribución a la síntesis de alcoholes superiores fue escasa. El acetato de 2-feniletilo sólo se sintetizó por las levaduras indígenas cuando éstas no compitieron con la levadura inoculada.

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