RESUMEN:

La diversidad poblacional de cepas levaduriformes en el Marco de Jerez provoca que la mayoría de las bodegas inoculen sus mostos preparados para fermentar con Levaduras Secas Industriales de unas características determinadas encaminadas a conferir al producto final, el vino, unas cualidades organolépticas específicas.

Estas adiciones se hacen siempre con una técnica muy particular en esta zona vitivinícola: el pie de cuba. Consiste en hacer una prevendimia, obteniendo un pequeño volumen de mosto al cual se le inocula con una determinada levadura. Este pequeño volumen, una vez comenzado a fermentar, se adicionará al resto de los depósitos de mosto obtenidos en la vendimia.

Con todo ello, este trabajo estudia la dinámica poblacional de levaduras en 5 depósitos de mosto uno de los cuales se deja con una fermentación espontánea mientras que el resto es inoculado con Levaduras Industriales. Así, la utilización de técnicas microbiológicas y moleculares permite la caracterización de estas especies de levaduras pudiendo por consiguiente, conocer la trayectoria fermentativa de las levaduras encontradas y sirviendo al bodeguero como levadura patrón encargada de dirigir los depósitos de fermentación.

En este trabajo se hizo un análisis de 500 aislamientos encontrándose que la variedad poblacional de cepas levaduriformes presentes en el mosto disminuye a medida que transcurre la fermentación tumultuosa a consecuencia de la instauración de las cepas levaduriformes propiamente fermentativas. Además, se hallan varias cepas levaduriformes con un mismo patrón metabólico. Sin embargo, la utilización de técnicas moleculares (Electroforésis en Campo Pulsante) muestra que un mismo patrón metabólico en varias cepas levaduriformes se corresponde con patrones cromosómicos diferentes.

Por último, se han recogido 16 patrones metabólicos distintos que han dado lugar posteriormente a 20 patrones cromosómicos diferentes, de forma que la aplicación de estos resultados permite la selección de una determinada cepa levaduriforme caracterizada microbiológica y molecularmente para realizar cultivos dirigidos que supongan una mejora en el proceso de fermentación del mosto.

INTRODUCCIÓN:

El vino de Jerez procede de una elaboración muy cuidada y especial. Sin esta elaboración y cuidados, este vino no poseería muchas de sus más excelentes y acusadas características. Pero esa elaboración es posible gracias a la materia prima que proporciona el viñedo, de composición muy determinada y de gran finura y elegancia, consecuencia de un cúmulo de factores propios de la viticultura jerezana. En el Marco de Jerez, la madurez de la uva suele variar en función de la climatología de ese año, de forma que normalmente la época de vendimia suele ser sobre la 4ª semana de Agosto. Para este momento, el índice más generalizado es el que se obtiene de la relación entre la cantidad del mosto y los ácidos contenidos en el mismo (1).

Con el prensado de la uva se obtiene el mosto de la misma, la cual, con las levaduras propias (autóctonas o silvestres) fermenta, obteniéndose el vino. En esta operación es muy importante que la uva recepcionada esté sana y entera para que la contaminación bacteriana sea prácticamente nula. Esta operación de prensado y el resto que se encamina a transformar el mosto en vino, respetando todas las cualidades de la uva, se define como vinificación (2). Así, los mostos de mayor calidad se obtienen a presiones inferiores a 1 atm., denominándose mostos de 1ª yema. Los mostos obtenidos con presiones entre 1 y 4,5 atm. se denominan mostos de 2ª yema.

Se ha comprobado que se produce un aumento de polifenoles y de color en aquellos mostos que han sido sometidos a una mayor presión y que posteriormente en el vino se traduce en un descenso de los niveles de glicerina y acidez volátil así como un incremento de color (3).

Durante esta vinificación se utiliza de forma tradicional la incorporación de los denominados factores de corrección (ácido tartárico ó cítrico y sulfato de calcio) en diferentes fases del proceso y en distintas proporciones, desempeñando un papel básico tanto desde un punto de vista enológico como sobre los microorganismos acompañantes (4) (5).

La reducción del pH por la adición de ácidos y sulfatos de calcio junto con el dióxido de azufre y etanol reduce de forma importante la presencia de bacterias y efectúa una selección sobre las levaduras.

El anhídrido sulfuroso añadido ejerce una selección mayoritaria de especies del género Saccharomyces, no aislándose especies del género Pichia, Hansenula o Candida (6). Estos últimos no aportan ningún valor enológico al producto final y son incapaces de resistir al etanol producido durante la fermentación (7). En el Marco de Jerez se encuentran las siguientes levaduras mayoritarias: Saccharomyces cerevisiae ellipsoideus, S. chevalieri, S. exigus, S. fermentati, S. rosei, S. mangini, S. oviformis, S. italicus, S. veronae (6). También se han aislado especies pertenecientes a otros géneros como son: Kloeckera, Candida, Pichia, Hansenula, Torulaspora, Sacchatomycodes (8) (9).

Dada la gran diversidad de cepas levadurifomes, las bodegas hoy en día seleccionan y cultivan un tipo de levadura característica para provocar la fermentación. Para que esta fermentación sea uniforme en todo el volumen del depósito se emplea el pie de cuba (10). Éste consiste en la adición de la levadura seleccionada sobre una cierta cantidad de mosto obtenido de una prevendimia de ese mismo año. Como resultado se obtiene un mosto fermentado, que se añadirá al resto del mosto sin fermentar alojado en el depósito de fermentación. Con esto se favorece el desarrollo rápido de las levaduras fermentativas en el mosto, la reducción de infecciones bacterianas así como un mayor control de la fermentación (11). Una vez añadido el pie de cuba y al cabo de unas horas, comienza la fermentación, que es muy fuerte en su comienzo y que se conoce como fermentación tumultuosa. Transcurridos 3 ó 4 días desaparece el calor y la turbulencia propia de la fermentación tumultuosa comenzando la 2ª fermentación, más lenta y menos violenta que la primera.

Durante la fermentación industrial espontánea del mosto predominan 3 especies de levaduras como son: Saccharomyces ceerevisiae, S. fermentati y S. chevalieri, mientras que si la fermentación es dirigida mediante un pie de cuba, lo hace la levadura seleccionada. Esta eficacia del pie de cuba disminuye a lo largo del periodo de vendimia, debido a un aumento progresivo de la microbiota silvestre en el mosto (5). En mostos de Jerez se han aislado principalmente especies de levaduras pertenecientes a otros géneros: Kloeckera, Candida, Pichia, Hansenula, Saccharomyces, Sccharomycodes y Hanseniasporas (12). Sin embargo, desde un punto de vista enológico, destaca el género Saccharomyces y en especial Saccharomyces cerevisiae, S. chevalieri, S. fermentati y S. italicus.

En el caso de fermentaciones espontáneas, se pueden establecer hasta 3 fases según el tipo de levaduras que se encuentren. En una primera fase predominan levaduras apiculadas, productoras de bajo grado alcohólico e importantes concentraciones de ácidos volátiles (fundamentalmente acético). En una segunda fase, predominan de forma casi constante especies de gran pureza fermentativa y productoras de un grado alcohólico medio. La tercera fase recoge el dominio de distintas especies del género Saccharomyces, típicamente alcoholígenas y que terminan el proceso fermentativo en el consumo total de los azúcares (13).

Microbiológicamente hablando, la sulfitación del mosto hace una selección sobre especies del género Saccharomycodes, desapareciendo especies no ascoporógenas como Kloeckera apiculata y Candida pulcherrina. Por su parte, el efecto del etanol reduce la presencia de Kloeckera aumentando la de Saccharomyces. Esta selección de la microbiota a lo largo del proceso fermentativo es lo que permite obtener una serie de componentes secundarios. Así, se puede confirmar que Kloeckera apiculata y Pichia fermentans producen muy poca cantidad de alcoholes superiores o ésteres etílicos y que Pichia se considera una levadura indeseable en el proceso fermentativo.

El mosto fermentado, y ya por tanto vino (con graduación que va entre 10,5º y 11º), se “encabeza” con alcohol vínico (etanol) hasta obtener una graduación de 15,5º. Aquí son las levaduras de flor (Saccharomyces) las que utilizarán el etanol como fuente de carbono formando una fina película en la superficie del vino originando la Crianza Biológica del vino de Jerez. Es en este velo de flor donde se han aislado y caracterizado distintas especies de Saccharomyces. Se observa un alto polimorfismo entre las especies del género Saccharomyces siendo de gran ayuda a la hora de analizar la microbiota presente durante la fermentación espontánea del mosto (2). Para esto se cuenta con técnicas de biología molecular que permiten una caracterización rápida de un alto número de cepas de levaduras, ya sea en una fermentación espontánea del mosto o en una fermentación dirigida a través de levaduras industriales en el depósito de fermentación (15). La secuencial sustitución de las cepas a lo largo de la fermentación debe asociarse a las distintas fases de la fermentación. Si la levadura inoculada en el depósito de fermentación tiene un bajo grado de similitud con la microbiota natural, la primera predominará de forma clara al final del proceso de fermentación. Por otra parte, si el grado de similitud es alto, se produce una progresiva sustitución de las cepas predominantes durante cada fase de la fermentación, de forma que la levadura inoculada en el depósito de fermentación tendrá problemas para instaurarse como levadura definitiva al final de la fermentación, debido a las numerosas cepas con las que se enfrenta en las distintas fases de la fermentación. Por ello, se notará una progresiva reducción de la diversidad de cepas levaduriformes halladas desde el primer día en que comenzó la fermentación (16).

Las levaduras no ascoporógenas como Kloeckera apiculata y Candida pulcherrina solamente se detectan en la primera fase de la fermentación, por lo que aún formando parte de la microbiota de la uva no tendrán ningún papel importante a lo largo del proceso de fermentación. En el caso de las inoculaciones, Saccharomyces se ve poco influenciada, mientras que Candida stellata se ve muy afectada (17). Por su parte, las especies ascoporógenas de los géneros Pichia y Hansenula se encuentran normalmente en aislamientos realizados en la primera fase de la fermentación, pero así como las especies de Hansenula no se vuelven a detectar, las de Pichia se detectan al final del proceso fermentativo. En cuanto a las especies del género Saccharomyces, éstas constituyen la flora dominante, variando en número y proporción, destacando las especies Saccharomyces rosei, S. fermentati y S. chevalieri.

Por último, el porcentaje de bacterias que se pueden encontrar y que acompañan a los mostos sin corregir durante todo el proceso confirma la necesidad de un control del mosto durante todo el proceso fermentativo.

MATERIALES

Se presentan cinco depósitos de fermentación de 500 litros cada uno. De éstos, cuatro fueron inoculados con Levaduras Secas Activas Industriales, mientras que el quinto depósito se dejó que tuviera una fermentación espontánea (depósito testigo). Se realizan un total de 500 aislamientos, comprendiendo una recogida de muestras de los siguientes períodos:

• mismo día de la inoculación
• a las 24 horas de realizar la inoculación
• a las 72 horas de realizar la inoculación
• a las 120 horas de realizar la inoculación

Las cepas de levaduras empleadas para las inoculaciones fueron las siguientes: Fermol Clarifiant (Saccharomyces cervisiae C94); Fermol Primeurs (Saccharomyces cerevisiae R.F.); Fermivin (Saccharomyces cerevisiae); Uvaferm CM (Saccharomyces cerevisiae C.M.). Las características analíticas del mosto fueron: ºBe: 11; pH: 3,18, A_T: 5,10; SO_2T: 115.

Las muestras fueron recogidas en pequeños depósitos estériles y tratados inmediatamente para evitar contaminaciones exteriores.

Para las determinaciones microbiológicas se utilizaron distintos productos químicos, mientras que para las determinaciones en Biología Molecular se utilizaron otros en función de su aplicación (obtención de esferoplastos, preparación de muestras para realizar la electroforesis en Campo Pulsante, lavado de los bloques de agarosa etc.). Como indicador se utilizó Púrpura de Bromocresol al 4% en etanol.

El tampón utilizado para la obtención del cariotipo electroforético fue TBE (Tris 45mM, Ácido Bórico 45 mM y EDTA 1mM pH:8 ).

Para las muestras fue necesaria la utilización de medios de cultivo para las levaduras:

• Medios mínimos:




• YNB (formado por una base nitrogenada con aminoácidos, sulfato amónico y agar).
• YNB+Galactosa
• YNB+Glucosa
• YNB+Lactosa
• YNB+Maltosa
• YNB+Rafinosa
• YNB+Sacarosa

Para la asimilación de fuentes de nitrógeno:

• YCB: control negativo, formado por base carbonatada y agar.
• YCBA: control positivo, formado por base carbonatada, sulfato amónico y agar.
• YCBN: formado por base carbonatada, nitrato potásico y agar.

• Medios completos




• para aislamientos y conservación de las muestras: YPD (extracto de levadura, peptona, glucosa y agar); YPG (YPD+glicerol); YPDG (YPG+glucosa).
• Para pruebas de fermentación en estado líquido: se parte de un medio completo YE (extracto de levadura y una solución de púrpura de bromocresol). A este medio se añaden los diferentes azúcares fermentables, dando lugar a: YEL (YE+ lactosa); YEG (YE+galactosa); YEM (YE+Maltosa); YER (YE+Rafinosa); YES (YE+Sacarosa); YED (YE+Glucosa).

MÉTODO

Recogidas las muestras, éstas se centrifugan obteniendo un pellet donde se recogen todas las levaduras de la muestra. Para el aislamiento de las muestras se hicieron diluciones que iban desde 1/10 hasta 1/1000000. Se inocularon en las Placas Petri durante 3-4 días a 28ºC (17). Una vez crecidas las colonias de levaduras se seleccionaron de las mismas un total de 20 colonias por muestra. Dado el gran volumen de muestras se hicieron 3 formas de conservación: en la propia Placa Petri YPD sólido, glicerinados a –80ºC y liofilizados.

Para revitalizar posteriormente las muestras se tomaron 100 microlitros de la muestra y se añadieron a otros 100 microlitros de YPD líquido dejando incubar la muestra durante unos días con una agitación suave.

CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA

Tiene lugar atendiendo a 2 ámbitos: macroscópicos (forma y tamaño de las levaduras) y microscópicos (estudio del tipo de reproducción vegetativa, formación de las agrupaciones celulares, etc.)

La caracterización fisiológica de la célula se realiza atendiendo a la fermentación de distintas fuentes de carbono, la asimilación de nitratos como única fuente nitrogenada y la capacidad de hidrolizar Arbutina.

Fermentación de azúcares.

El gas producido como consecuencia de la fermentación se recoge en el interior de las campanas Durham, las cuales están sumergidas en el medio de cultivo correspondiente, formado este por extracto de levadura, peptona y el azúcar que se quiere probar. Se utilizan tubos de 5ml a los que se añaden 1,5 ml de medio de cultivo. La campana Durham también se llena. El conjunto de los dos tubos se tapa con algodón, esterilizándose en autoclave a vapor efluente a 126ºC durante 20´. Una vez enfriado el medio, se efectúa la inoculación. Los tubos inoculados se introducen en una incubadora orbital con una agitación de 120 rpm y 28ºC durante 20 días. Tanto la producción de gas como una acidificación del medio corresponden a una prueba positiva.

Asimilación de azúcares

Con esta prueba se permite clasificar las levaduras en función de su capacidad de metabolizar los azúcares que no han fermentado por vía oxidativa. Se ha empleado el método seguido por Capriotti (1955) y descrito por Suárez e Iñigo (1992). La prueba se realiza en placas Petri con medio sólido. La incubación de las placas inoculadas se realiza en una estufa a 28ºC durante 15 días.

Asimilación de nitratos

Se trata de comprobar la asimilación de nitratos como única fuente de carbono. La metodología la describe Stelling-Deker (1931) y, posteriormente, Lodder (1970).

Escisión de Arbutina

Se comprueba en este caso la presencia del enzima ß-glucosidasa. El método seguido es de Diddens y Lodder, citado por Lodder y Kreger Van Rij (1970). Se parte de un medio sólido en Placa Petri que contiene Arbutina y cloruro de Hierro (III). Las colonias se dejan incubar a 28ºC. Si la levadura es capaz de escindir la Arbutina (por tanto prueba positiva) aparece una coloración oscura en el medio sólido como resultado de que ha actuado la ß-glucosidasa.

CARACTERIZACIÓN MOLECULAR.

Su finalidad es la de obtener un patrón de bandas correspondientes al cariotipo electroforético de cada una de las cepas de levaduras analizadas. Para esta caracterización es necesario en primer lugar, la obtención de esferoplastos (células de levaduras a las que se les ha degenerado de manera parcial su pared celular). Se parte de un cultivo de levaduras sembradas en Placas Petri con un medio YPD sólido. Se inocula en un erlermeyer que contiene una cantidad aproximada de 150 ml de YPD líquido. Se tapa el erlermeyer con un algodón hidrófobo, dejando crecer el cultivo durante toda la noche en el agitador orbital a 120 rpm. En el momento en que se alcance la fase exponencial, el cultivo debe tener una densidad óptica de 660 nm (en la fase exponencial la pared celular es más débil que en la fase estacionaria).

Una vez comprobada la fase exponencial, se centrifuga a 5000 rpm. Se deshecha el sobrenadante y el pellet se resuspende en 100ml de solución I (sorbitol 1M y EDTA 25mM pH:8). Luego, se añaden 5 mg de Ditiotreitol incubando la suspensión a 28ºC durante 1,5h en agitación entre 40 y 70 rpm. Transcurrido este tiempo, se centrifuga la suspensión a 3500 rpm durante 5 minutos. El pellet se lava con solución II (sorbitol 1M), resuspendiendo y centrifugando a 3500 rpm durante otros 5 minutos. De esta forma se elimina el agente complejante EDTA. Después de este lavado se vuelve a resuspender el precipitado en 10 ml de solución II y se añaden entre 3 y 5 mg de enzima lítico. La suspensión se deja en agitación suave durante 28ºC durante el tiempo preciso para que se forme la mayor cantidad de esferoplastos posibles.

El cálculo de esferoplastos se realiza en una cámara cuentaglóbulos. Una vez contados, se centrifuga durante unos minutos a 3500 rpm., resuspendiendo el precipitado en un volumen determinado de solución III (Sorbitol 1M y EDTA 50 mM pH:8), de forma que la concentración final sea de 2.108 esferoplastos mililitro.

Preparación de los bloques de agarosa.

Se consigue haciendo una solución entre los esferoplastos y la agarosa de bajo punto de fusión (Low Melting) al 1% p/v en la solución III. Para disolver la agarosa en la solución III es necesario calentarlo. Aprovechando este estado líquido de la agarosa y de los esferoplastos, se añaden a unos moldes de unos 100 microlitros cada uno, dejándose enfriar. Estos moldes o plugs se conservan en eppendorf en el frigorífico para evitar degradaciones hasta su tratamiento de lisis de los esferoplastos. La concentración final de los plugs es de 1x10⁸ esferoplastos/ml.

Lisis de los esferoplastos

Los plugs se añaden a un nuevo eppendorf cubriéndolos con una solución denominada ESP (N-Laurosilsarcosina al 1%, EDTA 0,5 M pH:9 y proteinasa K 1mg/ml). Para asegurar la efectividad de la proteinasa K, los eppendorf deben estar en un baño termostatizado a 50ºC. Luego, transcurrido un tiempo, se retira el ESP y se lavan los plugs en EDTA 50 mM pH: 8. Al finalizar el lavado, estos plugs se conservan en EDTA 50 mM pH:8 en frío.

Electroforesis en Campo Pulsante

Es una técnica de separación mediante la aplicación de un campo eléctrico a través de una malla de gel de agarosa especial. Esta electroforesis se realiza en el aparato CHEF-DR-II (Bio-Rad, USA). Contiene 24 electrodos dispuestos en forma hexagonal acoplados a un módulo de control. Para confeccionar el gel hay que tener en cuenta una serie de variables, como son: la agarosa (en función del tamaño de los fragmentos a separar) el volumen del gel, la concentración de la agarosa (de ella depende el tamaño de los huecos dejados por la malla, facilitando el paso de los cromosomas) y el tampón de la solución que permite la conducción de la corriente eléctrica a través del movimiento de los iones disueltos. En estos casos se utilizó TBE 0,5X (Tris Base, EDTA 0,5 M pH:8 y ácido bórico) y TAE 1,0X (Tris Base, EDTA y acetato) en función de los tamaños de separación.

Una vez realizada la electroforesis, se separa el gel de la placa y se introduce en una solución de bromuro de Etidio 0,5 mg/ml (19). El bromuro de Etidio tiñe específicamente el DNA. Luego se introduce en una cubeta de tampón durante el tiempo necesario para eliminar zonas de tinción inespecíficas o demasiado teñidas. A continuación, el gel se coloca en un transiluminador de luz ultravioleta que revela las zonas teñidas con Bromuro de Etidio. La imagen es captada por la cámara y digitalizada mediante el programa informático Molecular Analist de Bio-Rad.

RESULTADOS

Microbiológicos

Después de analizar las muestras se encuentran 16 patrones metabólicos diferentes atendiendo a los resultados de las pruebas realizadas y que se denotan por PI hasta PXVI.

En la siguiente tabla se muestran los resultados microbiológicos (fermentación y asimilación de azúcares, asimilación de nitratos y escisión de arbutina).

Aunque algunos patrones son muy similares entre sí, tenemos una primera aproximación de la variedad poblacional que traía el mosto. Según estos resultados, el patrón metabólico PIV es el mismo patrón metabólico obtenido por las cepas industriales inoculadas. Esto indica que el patrón metabólico PIV corresponde a muestras de cepas vínicas de poder fermentativo muy fuertes, responsables de la fermentación tumultuosa que tiene lugar en el mosto. Esto también ocurre con las cepas inoculadas comerciales que son cepas de alto poder fermentativo y que llevan la dirección de la fermentación del mosto, de forma que no dejan que otras levaduras silvestres intervengan de forma inicial en la fermentación. Asimismo, estas pruebas ofrecen la capacidad de diferenciar entre levaduras incluidas dentro de la misma especie Saccharomyces cerevisiae, pero con funciones distintas dentro del proceso de elaboración del vino de Jerez.

Analizando las muestras de días posteriores, se comprueba de manera general cómo el patrón IV va aumentando en porcentaje de forma que a las 120 horas de la inoculación, todos los depósitos, incluso el depósito sin inocular, contienen como mayoritario al patrón metabólico PIV. Esto llevaría a dos hechos:

En los depósitos inoculados la cepa industrial se ha hecho cargo de la fermentación, no dejando que otras cepas de levaduras intervengan en el proceso fermentativo.

En el depósito sin inocular, el patrón PIV se instauraba como la cepa fermentativa por excelencia.

En los gráficos recogidos en el FIGURA I se muestran las evoluciones que tienen las cepas levaduriformes en los 5 depósitos, observándose cómo a medida que transcurre el tiempo de inoculación, hay cepas que desaparecen en beneficio de otras que se ven incrementadas en porcentaje respecto del total.

Los datos indican que no hay uniformidad a la hora de instaurar la cepa de levadura en el depósito. Así, en el depósito número 3 inoculado con Fermivin, el tiempo de instauración en el depósito es mucho más corto que en el resto de los depósitos inoculados con otras cepas de levaduras donde la instauración es mucho más lenta (aunque al final todos los depósitos presentan un mismo patrón fermentativo PIV). Sin embargo, los posteriores análisis realizados mediante técnicas de Biología Molecular confirman que esta instauración de la levadura inoculada no es tan apreciable como cabría esperar.

En el depósito sin inocular (número 5) se observa una gran diversidad poblacional, de forma que se encuentran hasta 7 patrones metabólicos diferentes (frente a los 2-4 patrones diferentes en el resto de los depósitos). Esto da idea de la competencia entre las diversas cepas levaduriformes. A medida que aumenta el tiempo de la fermentación, desaparecen determinadas cepas levaduriformes en beneficio de otras que aumentan en porcentaje.

El progresivo aumento del nivel alcohólico en el medio fortalece la presencia de determinadas cepas de levaduras que serían las que finalizan todo el proceso fermentativo dando lugar a un vino con una graduación alcohólica en torno a los 11º.

Según Mora, J. et. al. (1990) las especies apiculadas Kloeckera apiculata y Kloeckera apis se mantienen en frecuencias bajas hasta el segundo día. Saccharomyces cerevisiae no se empieza a aislar hasta el tercer día, pero es la especia dominante el quinto día.

Puesto que el tipo de cepa inoculada corresponde a Saccharomyces cerevisiae se debe pensar que el patrón metabólico PIV descrito, también corresponde a cepas del tipo S. cerevisiae. Posteriores análisis de Biología Molecular muestran efectivamente que la cepa S. cervisiae es la que se instaura, pero no en todos los depósitos coincide con la cepa de levadura inoculada.

Toda esta diversidad poblacional encontrada justifica aún más, si cabe, el empleo del pie de cuba, ya que supone una disminución del tiempo de inicio de la fermentación, favoreciendo el rápido desarrollo en el mosto de las levaduras fermentativas, la reducción de la posibilidad de infección bacteriana y poder llevar a cabo una programación, tratamiento y control de la vendimia.

Para la preparación del pie de cuba todo el proceso debe hacerse en máximas condiciones estériles, tratando de garantizar la pureza del cultivo, debiendo representar al menos un 4% del volumen del mosto total a fermentar.

RESULTADOS MOLECULARES

Una vez obtenido los 16 patrones diferentes, se hicieron los protocolos necesarios para la obtención de los distintos patrones cromosómicos. Para el estudio de la evolución de las distintas cepas levaduriformes, se utilizaron como control los patrones cromosómicos de las cepas inoculadas (FIGURA II).

Las cuatro cepas inoculadas muestran patrones cromosómicos típicos de S. cerevisiae con bandas que van desde 2200 Kb. hasta 220 Kb. Es característica la presencia de una banda de peso molecular de 1100 Kb en el patrón Fermol Primeurs, así como el hecho de una no uniformidad en el número de bandas, ya que Fermol Clarifiant posee 16 bandas, Fermol Primeurs y Fermivin tienen 15 bandas y Uvaferm CM tiene 14 bandas cromosómicas.

Cariotipo electroforético de los patrones metabólicos PI y PX. (VER FIGURA III)

Corresponden a cepas de levaduras no Saccharomyces. Su aspecto morfológico en la placa se identifica con un crecimiento de forma irregular, color blanquecino, translúcido, con elevación plana, superficie rugosa, borde dentado y aspecto mate.

Cariotipo electroforético de los patrones II y III.

Corresponden a cepas levaduriformes no Saccharomyces cerevisiae.

Cariotipos electroforéticos del patrón PIV (VER FIGURA IV, V y VI)

Los resultados se centrarían en comprobar si el patrón metabólico PIV obtenido a las 120 horas de realizada la inoculación corresponde al mismo patrón cromosómico de las cepas industriales inoculadas. Así, los resultados han sido dispares. En algunos depósitos se comprueba que la cepa inoculada no se ha instaurado a las 120 horas de producirse la inoculación, mientras que en un depósito sí se ha instaurado, coincidiendo los cariotipos electroforéticos. En el caso de los depósitos 1 y 5 se encuentran varios cariotipos electroforéticos pertenecientes al patrón PIV, lo que muestra la gran diversidad de población levaduriforme hallada en el mosto, de forma que aún presentando iguales patrones metabólicos son, en realidad, distintas cepas de levaduras.

El depósito 1 fue inoculado con Fermol Clarifiant, obteniendo hasta tres cariotipos electroforéticos con un mismo patrón metabólico PIV. Ninguno de ellos corresponde al cariotipo electroforético de la cepa Fermol Clarifiant tanto en el número de cromosomas como en sus posiciones en el gel, demostrando que la levadura inoculada no se ha instaurado de manera definitiva en este depósito a las 120 horas de realizar la inoculación.

En el depósito 2 se inoculó la cepa Fermol Primeurs apareciendo un solo cariotipo electroforético perteneciente a este patrón PIV. En una comparativa entre los cariotipos electroforéticos correspondientes se comprueban las diferencias entre ellos (VER FIGURA IV).

El depósito 3 se inoculó con la cepa Fermivin. Los resultados muestran un patrón metabólico PIV instaurado a las 24 horas de la inoculación. Realizado el correspondiente cariotipo electroforético, se comprueba cómo este es el mismo que el cariotipo electroforético de la cepa inoculada Fermivin, pudiendo afirmar que a las 120 horas la fermentación es dirigida por la cepa inoculada en este depósito (VER FIGURA V).

Para el depósito 4, inoculado con la cepa Uvaferm CM, se comprueba que los cariotipos electroforéticos correspondientes al patrón PIV instaurado y la cepa inoculada no coinciden, lo cual indica la no instauración de la cepa inoculada después de las 120 horas de realizada la inoculación (VER FIGURA VI).

Los pesos moleculares obtenidos en los cariotipos electroforéticos de los patrones metabólicos PIV instaurados a las 120 horas en los depósitos 2 y 4 son los mismos, lo cual muestra cómo estas levaduras silvestres no son propias de un depósito de fermentación y de un día característico de la vendimia, sino de una cepa levaduriforme que se halla plenamente asentada en los viñedos de la zona.

Tomando como referencia el cariotipo electroforético PIV de los depósitos dos y cuatro (13 bandas) se puede decir que: 1.- en el depósito uno se encontraron tres patrones cromosómicos distintos, correspondiendo dos con trece bandas; entre estos dos patrones cromosómicos y el encontrado en los depósitos dos y cuatro solo hay una diferencia de cuatro o dos bandas, lo cual hace pensar en la similitud de todas estas cepas levaduriformes, 2.- En el caso del depósito número cinco, sin inocular, se halla un cariotipo electroforético de trece bandas, presentando una diferencia con el cariotipo electroforético de los depósitos dos y cuatro de cuatro bandas, lo que también indica la similitud entre ellos.

En el depósito cinco se encuentran hasta tres cariotipos electroforéticos correspondientes a un mismo patrón metabólico PIV. Conduce esto a pensar en la alta competitividad existente entre las cepas levaduriformes en el transcurso de la fermentación tumultuosa (VER TABLAS I, II y III).

Cariotipo electroforético del patrón V

Encontrado en el depósito 1, desapareciendo a las 24 horas de realizada la inoculación. Contiene trece bandas con un intervalo entre 2200-225 Kb.

Cariotipo electroforético patrón VI

Aparece en los depósitos 3 y 5 el mismo día de la inoculación. También aparece en el depósito uno a las 24 horas de realizada la inoculación. Contiene 14 bandas con un intervalo de bandas entre 2200-225 Kb.

Cariotipo electroforético patrón VII

Encontrado en el depósito 3 el mismo día de la inoculación de dicho depósito. Contiene catorce bandas con un intervalo entre 2200-220 Kb.

Cariotipo electroforético patrón VIII

Aparece en el depósito 4 el mismo día de la inoculación así como a las 72 horas de realizada la inoculación. También aparece en el depósito cinco a las 24 y 72 horas. Su cariotipo contiene trece bandas con un intervalo entre 2200-225Kb.

Cariotipo electroforético patrón IX

Perteneciente a una levadura no Saccharomyces, se muestra en los depósitos 4 y 5 el mismo día de la inoculación. Desaparece en los días posteriores. Sin embargo, este cariotipo sí aparece en el depósito 2 a las 24 horas de realizada la inoculación. Su poca actividad la hace poco competitiva frente a las cepas Saccharomyces. Este cariotipo contiene siete bandas con un intervalo que varía entre 2043-974 Kb.

Cariotipo electroforético patrón XI

Encontrado solamente en dos muestras del depósito 5, en el primer día de la inoculación. Muestra un cariotipo electroforético de 4 bandas con un intervalo de 2200-225 Kb.

Cariotipo electroforético patrón XII

Obtenido exclusivamente en el depósito 1 a las 24 y 72. El cariotipo electroforético contiene 15 bandas con un intervalo de 2200-225Kb.

Cariotipo electroforético patrón XIII

Aparece sólo a las 24 horas de realizada la inoculación en el depósito 5. El cariotipo contiene 14 bandas con un intervalo entre 2200-225Kb.

Cariotipo electroforético patrón XV

Encontrado en los depósitos 2 y 4 a las 24 horas de realizada la inoculación. Su cariotipo contiene 15 bandas con un intervalo entre 2200-225Kb.

DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS

La práctica del pie de cuba en una zona como el Marco de Jerez se hace imprescindible teniendo presente la gran variedad poblacional de cepas levaduriformes halladas en los primeros momentos de la fermentación tumultuosa y que podrían originar una dirección de la fermentación no deseada, resultando un mosto fermentado con unas calidades organolépticas no adecuadas. Uno de los métodos que presenta una mayor efectividad para combatir esta variedad poblacional es la inoculación con Levaduras Secas Activas, siempre que estas contengan unas propiedades particulares beneficiosas para realizar una buena conducción de la fermentación tumultuosa.

Las pruebas realizadas muestran cómo la variedad poblacional de cepas levaduriformes presentes en el mosto disminuye a medida que transcurre la fermentación tumultuosa a consecuencia de la instauración de las cepas levaduriformes propiamente fermentativas. Esta instauración se ha comprobado que no es homogénea en todos los depósitos inoculados, dependiendo de las características de la cepa inoculada.

A lo largo de este estudio he encontrado varias cepas levaduriformes que poseen un mismo patrón metabólico. Las pruebas a través de Electroforesis en Campo Pulsante muestran que un mismo patrón metabólico en varias cepas levaduriformes se corresponde con patrones cromosómicos distintos, lo que demuestra que las pruebas de Biología Molecular son imprescindibles para realizar una caracterización más detallada de las cepas levaduriformes encontradas. También es interesante comprobar la existencia de levaduras no Saccharomyces las cuales desaparecen al poco tiempo de comenzar la fermentación tumultuosa, debido a la poca competitividad de estas cepas levaduriformes frente a las cepas típicamente fermentativas de las razas Saccharomices cerevisiae.

En definitiva, la aplicación de los resultados obtenidos permite la selección de una determinada cepa levaduriforme caracterizada microbiológica y molecularmente para realizar cultivos dirigidos que supongan una mejora en el proceso de fermentación para los vinos del Marco de Jerez.

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