Introducción

El origen de los fenoles volátiles en los vinos tintos se conoce desde hace más de una década (Chatonnet, 1992). Pese a ello, un gran número de vinos presentan todavía este tipo de desviación. Desde un punto de vista organoléptico, el carácter fenolado se traduce, en los casos menos graves, en una pérdida de tipicidad y de finura mientras que en los casos más graves, se observa la presencia de un fuerte olor animal tipo “establo o sudor de caballo”. Desde un punto de vista analítico, la alteración se traduce por la presencia de dos compuestos: el etil-4-fenol (E4P) y el etil-4-guayacol (E4G). El umbral límite de percepción (concentración a partir de la cual se altera el aroma del vino) se estima en 426 mg/L para una mezcla 10/1 E4P/E4G (Chatonnet, 1992). En un mercado cada vez más competitivo, en busca de vinos auténticos y afrutados, el carácter fenolado, signo de una alteración microbiana, ya no es aceptable.

El origen microbiológico de los etilfenoles se ha determinado con claridad: las levaduras pertenecientes al género Brettanomyces bruxellensis están dotadas de un equipamiento enzimático que les permite formar grandes cantidades de E4P y de E4G a partir de ácidos fenoles presentes de forma natural en la uva (Chatonnet, 1992).

En el presente artículo, tras exponer las recientes investigaciones relativas al desarrollo de las Brettanomyces, presentaremos cuatro casos de contaminación registrados en los diferentes estadios del proceso de elaboración y propondremos diferentes estrategias de prevención, combinando un seguimiento analítico oportuno con una vinificación racional.

Situación de las investigaciones sobre las Brettanomyces

La microflora presente en la superficie de la baya de uva reúne micro-organismos de interés enológico (Saccharomyces cerevisiae, Oenococcus oeni) pero también especies nefastas como Brettanomyces. Por lo tanto, hay que tener presente que es la uva la que contamina la bodega. La detección de estas levaduras contaminantes en el viñedo es delicada, debido a que en este estadio son minoritarias. El proceso de transformación de los azúcares en alcohol por Saccharomyces cerevisiae va a implicar una auténtica “selección” de estos microorganismos. En efecto, las levaduras Brettanomyces son especialmente resistentes al etanol y al SO₂ y son capaces de sobrevivir en el medio a pesar de su empobrecimiento en azúcares. Recientes estudios ecológicos realizados en diferentes bodegas bordelesas (Renouf et al., 2006a) han demostrado también que, desde el encubado hasta el final de la FA (Fermentación alcohólica), las Brettanomyces son minoritarias en relación con las levaduras no-Saccharomyces. Por el contrario, a partir del final de la maceración, se vuelven más numerosas con respecto a las levaduras no-Saccharomyces, especialmente en los orujos y las lías. A partir de este estadio, podemos asistir a un desarrollo intempestivo de las poblaciones de Brettanomyces, que van a utilizar los ácidos fenoles y los azúcares residuales, presentes de forma natural, para producir grandes cantidades de etilfenoles.

Así, los finales inactivos en las fermentaciones o las maceraciones realizadas en condiciones poco higiénicas, se convierten a veces en el escenario de una multiplicación de Brettanomyces, ocasionando una alteración del vino. Después del sangrado, la fase de latencia antes de la fermentación maloláctica (FML) corresponde a un período muy propicio para su desarrollo. Durante la FML, el riesgo es menor, debido a la ocupación del nicho ecológico por las bacterias lácticas. Por último, durante la crianza, el desarrollo de Brettanomyces es por lo general más lento, por lo que puede controlarse más fácilmente. En este estadio, el riesgo de multiplicación depende esencialmente de las condiciones del medio. Aparte de una higiene impecable, se debe tener un perfecto control del sulfitado. Para ello, se debe tener en cuenta el valor de pH. En efecto, este último condiciona la proporción de SO₂ molecular, es decir, de SO₂ activo en relación con los microorganismos. El porcentaje de SO₂ molecular puede calcularse fácilmente con ayuda de la fórmula establecida por Sudraud y Chauvet (1985): 100/ (10^pH-1,81 + 1). Así, para un mismo contenido en SO₂ libre, la proporción de SO₂ molecular activo es, por ejemplo, dos veces menos importante con un pH 3,9 que con un pH 3,6. Para valores de pH elevados, a veces es delicado, incluso imposible, mantener el SO₂ en dosis suficientes. Llegado el caso, conviene aumentar el nivel de sulfitado durante el período estival, ya que las temperaturas elevadas favorecen el crecimiento de estas levaduras de contaminación. Además, es muy recomendable la puesta en práctica de un seguimiento analítico más exhaustivo con el fin de prevenir cualquier contaminación que pueda implicar un aumento del contenido en fenoles volátiles. La frecuencia de los trasiegos, así como el modo de limpieza de los recipientes, especialmente en el caso de una crianza en barrica, constituyen igualmente parámetros importantes. Una limpieza eficaz aplicada al parque de barricas seguida de un secado perfecto y de un azufrado son esenciales después de un trasiego. Para los vinicultores contrarios al trasiego, un seguimiento analítico que combine recuento de Brettanomyces y dosificación de fenoles volátiles, es el único medio de prevenir una alteración. La presencia de azúcares residuales, y en particular de glucosa-fructosa, constituye igualmente un elemento favorable para el desarrollo de estas levaduras de contaminación. Recientemente, la legislación ha autorizado a algunas denominaciones a elaborar vinos con contenidos en azúcares residuales relativamente importantes. Ahora bien, tan sólo un 0,3 g/L de glucosa-fructosa basta a una población de Brettanomyces para producir 425 mg/L de fenoles volátiles (Chatonnet, 1999). Señalemos también que, en ausencia de glucosa-fructosa, el crecimiento de las Brettanomyces resulta imposible a partir de otros azúcares no utilizados por Saccharomyces. Por último, durante la crianza, el oxígeno podría favorecer, directa o indirectamente, el crecimiento de las Brettanomyces (Renouf et al. 2006b). Por consiguiente, todas las etapas de la elaboración del vino que entrañen una disolución importante de oxígeno (trasiegos, rellenado de barricas, filtración, embotellado, etc.) podrían favorecer su desarrollo.

Ejemplos de alteraciones localizadas en los diferentes estadios del proceso de elaboración

Alteración al final de la FA

El primer ejemplo se refiere a una multiplicación precoz al final de la FA. Las características del mosto se presentan en la tabla 1. Se advierte una fuerte carencia de nitrógeno, un factor que limita el buen desarrollo de la FA (el umbral se sitúa alrededor de 130 mg/L, Belly, 1990). El proceso de elaboración se describe en la tabla 1. Cuando d = 1,010 se observa una ralentización de la FA hasta que d = 1,005, punto en el que la FA se detiene. En el momento en que se detiene, el contenido en fenoles volátiles es más de tres veces superior al umbral de percepción, lo que demuestra un desarrollo de Brettanomyces. Los orígenes de esta alteración pueden ser múltiples. Para empezar, a nivel prefermentativo, hay que saber que la maceración prefermentativa en frío, lejos de inhibir las Brettanomyces, refuerza su capacidad de adaptación al medio (Renouf et al., 2006b). De igual modo, a medida que se eleva la temperatura, se facilita su crecimiento. Cuando las levaduras intervienen después de esta maceración, el riesgo de fracaso de implantación de las LSA inoculadas - lo que podría llevar a una parada y a una eventual contaminación - es mayor. Probablemente sea éste el origen del problema en el caso descrito. Por último, a pesar del aporte de nitrógeno, la carencia de nitrógeno asimilable no se ha corregido del todo, lo que es un error.

Tabla 1. Caso de alteración al final de la fermentación alcohólica (2005).

Alteración entre FA y FML

El segundo ejemplo se refiere a una contaminación observada entre FA y FML. Las características del vino después de la FA se presentan en la tabla 2. Durante el sangrado, el vino presenta muy pocas Brettanomyces y su contenido en fenoles es despreciable. Doce días después del sangrado, la población de Brettanomyces y el contenido en fenoles volátiles han aumentado significativamente. Tres semanas después del sangrado, la FML se bloquea y prosigue el aumento de la población de Brettanomyces y del contenido en fenoles volátiles. Este tipo de contaminación se ha observado a menudo en el curso de la añada 2005. Se constata por otra parte, una correlación muy clara entre el tiempo de latencia FA-FML y el contenido en fenoles volátiles de vinos después de la FML (figura 1).

Tabla 2. Caso de alteración entre FA y FML (2005).

Figura 1. Relación entre el tiempo de latencia final FA / inicio FML y el contenido en fenoles volátiles de los vinos después de la FML (2005, n = 9)

Alteración durante la crianza

El tercer ejemplo se refiere a un desarrollo producido en el transcurso de una crianza en depósito, durante el período estival. La figura 2 presenta la evolución del contenido en fenoles volátiles en el transcurso del séptimo mes de crianza. En todas las mediciones del contenido en fenoles volátiles, la cantidad de SO₂ molecular es determinante: en cuanto el contenido en SO₂ molecular activo es inferior a 0,4 mg/L, aumenta el contenido en fenoles volátiles.

Figura 2. Seguimiento del contenido en fenoles volátiles y de la cantidad de SO₂ molecular activo en el transcurso de la crianza (2004).

Alteración después del embotellado

El último ejemplo se refiere a una alteración producida después del embotellado. Se trata de un vino de la añada 2001, cuyas características se presentan en la tabla 3. Este vino ha sido embotellado después de una filtración en el umbral de 2 mm. Inmediatamente después de ser embotellado, el vino no presenta un carácter fenolado. Tras dos años en botella, el contenido en fenoles volátiles es más de tres veces superior al umbral de percepción y sigue aumentando durante el año siguiente.

Estos distintos ejemplos nos muestran que las contaminaciones pueden producirse en diferentes estadios de la vinificación. Por consiguiente, conviene estar extremadamente alerta en todas las etapas.

Tabla 3. Caso de alteración después del embotellado (2001).

Medio de detección y de prevención de las alteraciones

Para controlar el riesgo Brettanomyces, tenemos a nuestra disposición, a día de hoy, tres herramientas analíticas eficaces:

• el recuento de levaduras Brettanomyces mediante cultivo en medio selectivo.
• el análisis de fenoles volátiles mediante SBSE/GC/MS.
• el microscopio de epifluorescencia.

No obstante, estas herramientas analíticas sólo son útiles si se emplean e interpretan de forma apropiada. Para empezar, hay que saber que no existe ninguna correlación entre el contenido de fenoles volátiles de un vino y su población de levaduras Brettanomyces (figura 3); lo que significa que se debería medir la evolución de estos dos parámetros mediante un seguimiento oportuno. A continuación, tal y como lo hemos mencionado anteriormente, la población de levaduras Brettanomyces se reparte de forma heterogénea en un mismo recipiente. La tabla 4 presenta los resultados de muestreos realizados en tres barricas, en superficie y en profundidad. En todos los casos, se registran escasas o ninguna Brettanomyces en superficie mientras que la población es sistemáticamente más elevada en el fondo de la barrica. Existe por lo tanto un gradiente de concentración entre la superficie y el fondo del recipiente; a escala de un depósito, este gradiente es probablemente todavía más marcado. A la vista de esto, se comprende la importancia de realizar trasiegos con regularidad con el fin de eliminar esta biomasa susceptible de contaminar la totalidad del recipiente. En efecto, por lo que respecta al contenido en fenoles volátiles, es idéntico en las dos zonas de muestreos. Por lo tanto, para un seguimiento analítico oportuno, es indispensable la dosificación de estos componentes, uniformemente repartidos.

Figura 3. Relación entre el contenido en fenoles volátiles de un vino y su población de levaduras Brettanomyces (vinos procedentes de diferentes DOC y añadas, n = 24).

Tabla 4. Heterogeneidad de la población de Brettanomyces dentro de un mismo recipiente.

La tabla 5 presenta un ejemplo de utilización de estas dos herramientas analíticas. Se refiere a una bodega en la que se debe hacer un ensamblaje de dos depósitos. En la cata, el depósito 2 no parece fenolado si bien presenta un contenido en fenoles volátiles superior al umbral de percepción. Este mismo depósito contiene una población elevada de levaduras Brettanomyces. En este caso, la puesta en práctica conjunta de los dos análisis permite tratar el depósito contaminado (filtración, flash-pasteurización, etc.) antes de ensamblarlo, evitando así la alteración de la partida entera.

Tabla 5. Ejemplo de utilización del análisis de fenoles volátiles y el recuento de levaduras Brettanomyces antes del ensamblaje.

Aparte de la utilización apropiada de estas herramientas analíticas, el riesgo de Brettanomyces debe controlarse a través de la gestión rigurosa de las diferentes etapas del proceso de elaboración. En este sentido, hemos querido profundizar en dos de los ejemplos de contaminación descritos anteriormente.

Control del riesgo de Brettanomyces a través de la gestión rigurosa de la fase prefermentativa y de la fermentación alcohólica.

En el caso de la contaminación al final de la FA (ver tabla 1), la mala gestión de la maceración prefermentativa es probablemente la responsable de un fracaso de implantación de la Levadura Seca Activa inoculada, ocasionando la inactividad fermentativa observada. En efecto, su realización a una temperatura más baja, su reducción en el tiempo mediante la utilización de enzimas de maceración, así como una siembra del mosto precoz, habrían favorecido ciertamente una mejor implantación de los fermentos. Por último, tal y como lo hemos subrayado anteriormente, a pesar del aporte de fosfato diamónico (DAP), la carencia de nitrógeno no ha sido corregida. En efecto, teniendo en cuenta el grado alcohólico elevado, hay que tender a un contenido del orden de 200 mg/L. Sabiendo que el contenido inicial del mosto era de 48 mg/L y que 20 g/Hl. de DAP aportan 40 mg/L de nitrógeno asimilable, habría sido necesario aportar unos 80 g/Hl. de DAP. Se ha demostrado recientemente que los mostos con una fuerte carencia de nitrógeno, la tienen también de lípidos (Dumeau et al., 2004). En este caso, la utilización de un preparador de levaduras rico en factores de supervivencia (esteroles, ácidos grasos), como el Superstart®, permite asegurar una buena terminación de la FA. Por último, recordemos que es necesario un sulfitado homogéneo y suficiente de las uvas durante la recepción para la buena implantación de los fermentos.

Control del riesgo de Brettanomyces a través de la gestión rigurosa de la FML

En el segundo ejemplo de contaminación mencionado anteriormente (ver tabla 2), el vino ha sido tratado por “flash-pasteurización” tras observar la parada de la FML. Este tratamiento curativo ha eliminado todas las poblaciones microbianas. Inmediatamente después del tratamiento, el vino ha sido sembrado con bacterias lácticas liofilizadas, permitiendo así la finalización de la FML sin aumentar el contenido en fenoles volátiles.

El período de latencia entre el final de la FA y el inicio de la FML, corresponde a un período muy propicio para el desarrollo de las levaduras Brettanomyces. Conviene por lo tanto reducir al máximo su duración. Se puede optimizar la gestión de la FML gracias a la utilización de bacterias lácticas liofilizadas, ya sea en co-inoculación, ya sea en inoculación secuencial una vez finalizada la FA. En el segundo caso, la siembra debe determinarse en función de dos elementos: el estado microbiológico del vino y su balance analítico. A la vista de los resultados analíticos obtenidos, se podrá poner en práctica una estrategia adecuada.

El microscopio de epifluorescencia constituye una excelente herramienta para conocer el estado microbiológico del vino. Permite en efecto medir muy rápidamente la carga microbiana del vino: en menos de una hora, se puede determinar la población bacteriana y se pueden obtener indicios de la presencia de microorganismos de contaminación como Brettanomyces. Por lo que respecta a este segundo punto, en caso de duda, la contaminación observada con el microscopio de epifluorescencia puede confirmarse mediante recuento en medio nutritivo específico. En función de las poblaciones observadas, se decidirá si procede una inoculación y/o si es necesario poner en práctica un tratamiento para eliminar una eventual población de levaduras Brettanomyces. En efecto, para asegurar un buen desarrollo de las bacterias lácticas, es absolutamente necesario eliminar estas levaduras de contaminación.

La elección del modo de inoculación, co-inoculación o inoculación secuencial, se hará en función de los hábitos de la bodega y de urgencia de la salida al mercado. En el caso de optar por una inoculación secuencial, los vinicultores podrán recurrir a un nuevo procedimiento de inoculación mediante bacterias preaclimatadas al vino, el proceso PreAc, (Laffort Œnologie), que permite un rápido desencadenamiento de la FML.

Seguimiento analítico preventivo que hay que poner en práctica

Como hemos visto a través de diferentes ejemplos, el control del riesgo Brettanomyces requiere un seguimiento analítico apropiado. La tabla 6 presenta el posicionamiento de las herramientas analíticas a nuestra disposición en cada estadio de elaboración, con el objetivo de realizar un seguimiento preventivo.

Tabla 6. Seguimiento analítico preventivo que debe ponerse en práctica.

En el estadio prefermentativo, la vigilancia de la carga microbiana mediante microscopio de epifluorescencia, permite verificar el control de las poblaciones autóctonas.

Durante la FA, la vigilancia de implantación de la cepa de levadura inoculada permite validar el control de las levaduras. En caso de ralentización de la FA, esta vigilancia es evidentemente muy necesaria; de hecho, debería acompañarse sistemáticamente de una medición del contenido en fenoles volátiles y de un análisis con microscopio de epifluorescencia. La dosificación de fenoles volátiles mediante SBSE/GC/MS permite un diagnóstico extremadamente rápido y fiable. Puede realizarse en un sólo día a partir de tan sólo 10 mL de vino. La presencia de fenoles volátiles indica una contaminación por Brettanomyces.

Durante la fase de latencia FA-FML así como en caso de FML inactiva, es muy recomendable poner en práctica un seguimiento analítico más exhaustivo, utilizando las tres herramientas a nuestra disposición: este seguimiento deber permitir predecir una multiplicación importante de las Brettanomyces.

Durante la crianza, el seguimiento mensual del contenido en fenoles volátiles es indispensable si se desea prevenir la aparición del carácter fenolado: cualquier aumento entre dos mediciones indica una contaminación. El recuento de las levaduras Brettanomyces, si bien a veces resulta útil, no es indispensable en este estadio, si se pone en marcha un seguimiento mensual o bimensual del contenido en fenoles volátiles. El interés de este tipo de seguimiento radica en poder actuar rápidamente, siguiendo una estrategia adecuada con el nivel de riesgo.

Por último, en el momento de la preparación para el embotellado, el conocimiento del nivel de población es indispensable para determinar los tratamientos previos al envasado. Evidentemente, una vez en botella, debe verificarse la eficacia de los tratamientos puestos en práctica.

Conclusión

Brettanomyces forma parte de la microflora natural de la uva, los profesionales deben aprender por lo tanto a gestionar la presencia constante de esta población microbacteriana durante todo el proceso de elaboración.

Por lo general, las alteraciones en el estadio prefermentativo y en el transcurso de la FA son raras. En caso de fermentaciones difíciles, alcohólica y/o maloláctica, el riesgo de multiplicación de Brettanomyces es importante. La perfecta gestión de las fermentaciones sigue siendo por lo tanto, en este estadio, el mejor medio de prevención: el nicho ecológico debe ser ocupado por los micro-organismos implicados en estas fermentaciones. Cualquier ralentización debe poner en alerta al enólogo y requiere la rápida puesta en práctica de una estrategia adecuada. En este sentido, las herramientas analíticas actualmente disponibles permiten determinar las elecciones enológicas y predecir contaminaciones irreversibles.

Después de la FML, el vino estabilizado contiene poblaciones bajas de Brettanomyces, más fáciles de controlar que durante la crianza. Así pues, para limitar el crecimiento de estos microorganismos, el enólogo debe poner en práctica todas las medidas en un estadio anterior, con el fin de iniciar la crianza con la población más baja posible. Aparte de una perfecta higiene y de un respeto a las reglas enológicas elementales, sólo un seguimiento analítico regular permite evitar un desarrollo excesivo de Brettanomyces durante la fase de crianza.

Bibliografía

Bely M. 1990. Détection automatique et correction des carences en azote assimilable des fermentations alcooliques en conditions œnologiques : étude cinétique et approche physiologique. Thèse de Biochimie, biologie cellulaire et moléculaire. Université de Montpellier.

Chatonnet P., Dubourdieu D, Boidron JN., Pons M., 1992. The origin of ethylphenols in wines. J. Sci. Food Agric., 60, 165-178.

Chatonnet. P., Masneuf I., Gubbiotti MC. et Dubourdieu D.1999. Prévention et détection des contaminations par Brettanomyces au cours de la vinification et de l’élevage des vins. Revue Française d’œnologie, novembre-décembre 99, N°179.

Dumeau F., Mansour C., Masneuf-Pomarède I. 2004. Le point sur les activateurs de fermentation. Revue des œnologues, N°113, p 21-23.

Renouf V., Falcou M., Miot-Sertier C., Perello MC., De Revel G. and Lonvaud Funel A. 2006a. Interactions between Brettanomyces bruxellensis and the others yeasts species during the first step of winemaking. Journal of Applied Microbiology (in press).

Renouf Vincent, Aline Lonvaud-Funel, Emilie Walling et Joanna Coulon. 2006b. Le suivi microbiologique du vin, Partie 1 : de la parcelle au conditionnement: un outil pour une œnologie raisonnée. Revue des œnologues, N°118, 27-31.

Sudraud P., Chauvet S. 1985. Connaissance Vigne et Vin, 19, 1, 31-40.